靶向双重抑制TBK1和IKKi的新型化合物抗舌癌作用及机制研究

【摘要】目的：(1)探讨TBK1和IKKi在人舌癌细胞增殖中的作用,为靶向抑制TBK1和IKKi治疗舌癌奠定理论基础。(2)验证新型化合物对TBK1和IKKi的抑制能力并评价其体外抗舌癌活性。(3)阐释TBK1和IKKi双重抑制化合物对舌癌细胞诱导凋亡和抑制增殖的作用,及其相关机制。(4)观察TBK1和IKKi双重抑制化合物在舌癌荷瘤裸鼠治疗效果,探讨其抑瘤作用及其发生机制,为其在舌癌治疗中的应用提供实验依据。方法：(1)常规培养人舌癌细胞株SCC-9,SCC-15,SCC-25,Westernblotting检测TBK1和IKKi及其磷酸化蛋白的表达情况,采用siRNA干扰技术分别抑制TBK1或/和IKKi后检测舌癌细胞增殖水平。(2)检测LPS刺激下鼠单核巨噬细胞RAW264.7的IRF-3活化水平对化合物的TBK1和IKKi抑制能力进行评估,并采用MTT法测定化合物作用下的舌癌细胞株增殖水平。(3)使用ApopTag原位凋亡检测试剂盒观察舌癌细胞在化合物200A作用下的凋亡现象,Westernblotting对化合物200A诱导舌癌细胞凋亡相关蛋白进行分析,并探讨凋亡机制。(4)建立SCC-9舌癌荷瘤裸鼠模型,应用TBK1和IKKi双重抑制化合物200A进行治疗,观察其对裸鼠肿瘤生长的影响及荷瘤裸鼠的毒性反应,采用免疫组化、Westernblotting、RT-PCR分析化合物200A治疗前后肿瘤组织的VEGF,p-AKT表达。结果：(1)三种舌癌细胞株中均可以检测到TBK1和IKKi及其磷酸化表达,p-IKKi的表达水平高于p-TBK1。siRNA干扰实验发现,与对照组比较,TBK1-siRNA,IKKi-siRNASCC-25两组细胞的增殖水平略有下降,但无统计学意义(P>0.05),但在SCC-25的TBK1和IKKi均被抑制后其增殖水平被显著抑制,与对照组相比具有统计学意义(P<0.01)。(2)Westernblotting发现三种化合物均能下调LPS刺激下的RAW264.7细胞中IRF-3的磷酸化水平,其中200A作用相对较强。MTT法发现三种化合物对三种舌癌细胞株均具有较好的抑制作用(IC50介于0.430-1.901μM),其中200A在这三种舌癌细胞株中具有均衡的、较低的IC50,表现出较高的抗舌癌细胞增殖活性。(3)形态学研究证实TBK1和IKKi双重抑制化合物可以促进舌癌细胞凋亡,随着化合物处理时间增长或化合物浓度增高,CleavedCaspase-9、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-7及CleavedPARP蛋白表达水平逐渐增高。舌癌细胞在TBK1和IKKi双重抑制化合物处理后,CyclinD1、p-AKT、p-CYLD蛋白表达水平下降。(4)实验过程中随着200A腹腔注射时间增长,其对实验组裸鼠肿瘤生长的抑制效果逐渐加强(图5-1)。从第22天起,两组之间肿瘤体积差异具有统计学意义(P<0.05),到第31天及之后,两组之间肿瘤体积差异具有更显著的统计学意义(P<0.01)。治疗过程中,裸鼠精神状态佳,生长发育、饮食活动均未见明显异常,表明化合物200A毒性反应小。实验结束时实验组的肿瘤重量小于对照组,具有统计学意义(P<0.05),瘤重抑制率为56.97%。免疫组化结果显示VEGF及p-AKT在实验组的阳性表达率明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),RT-PCR和Westernblotting分别验证了该结果。结论：(1)TBK1和IKKi在舌癌细胞中表达并活化,IKKi的磷酸化水平高于TBK1,同时抑制它们可有效抑制舌癌细胞的增殖,表明TBK1和IKKi可成为新型抗舌癌药物的分子靶点。(2)TBK1和IKKi双重抑制化合物SR8185、200A和200B具有抑制TBK1和IKKi勺能力,且可抑制舌癌细胞增殖,尤以200A相对最佳,可作为新型抗舌癌药物的候选化合物。(3)TBK1和IKKi双重抑制化合物具有抗舌癌作用,一方面细胞水平可呈时间和剂量依赖性诱导舌癌细胞凋亡、抑制其增殖,其机制可能与下调舌癌细胞CyclinD1、p-AKT、p-CYLD的蛋白表达有关；另一方面机体水平抑制舌癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长,无明显毒、副作用,可能因为抑制AKT活化,下调VEGF表达,进而抑制肿瘤血管生成,发挥其抗肿瘤作用。
【作者】李继佳；
【导师】彭解英；罗均利；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】新型化合物；TBK1；IKKi；舌癌；抗肿瘤；

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